Garantizar la confiabilidad y reproducibilidad de los experimentos en biología molecular depende de un riguroso control de calidad de las muestras de ARN y ADN. La evaluación de tres parámetros fundamentales – cantidad, pureza e integridad—es esencial para confirmar la idoneidad de los ácidos nucleicos en aplicaciones posteriores. Al monitorear cuidadosamente estos aspectos, los investigadores pueden asegurar el éxito de sus experimentos y mejorar la fiabilidad de sus hallazgos.
¿Cómo cuantificar la cantidad de ADN y ARN?
El método más común y rentable para la cuantificación precisa de ácidos nucleicos sigue siendo la espectrofotometría. Los espectrofotómetros estándar requieren de una cubeta de cuarzo y al menos 70 µL de muestra. Este volumen de muestra es elevado, aun utilizando una dilución de la misma. Los espectrofotómetros NanoDrop™ o similares son ideales por el requerimiento de volúmenes de muestra mínimos pues solo emplean entre 1 y 2 µL de muestra para el análisis de cuantificación y pureza.
La absorbancia de la muestra a 260 nm (A260) permite establecer la concentración de los ácidos nucleicos en una muestra basándonos en la Ley de Lambert-Beer que correlaciona de manera lineal -para A260<2.0- la absorbancia con la concentración, de tal modo que:
La fluorometría es otro método disponible para evaluar la cantidad del ARN y ADN. El mismo se basa en el uso de fluoróforos que se unen selectivamente a los ácidos nucleicos, por lo que es un método más específico que la espectrofotometría. La fluorometría ofrece una mayor sensibilidad en comparación con la espectrofotometría y evita la sobrestimación causada por contaminantes como proteínas (A280) o fenoles, EDTA, sales de guanidina o carbohidratos (A230).
¿Dispone de una muestra de ADN o ARN suficientemente pura?
Para establecer la pureza de los ácidos nucleicos se utilizan las lecturas de absorbancia a 280 nm y a 230 nm, estableciéndose un ratio con la lectura a 260 nm,
▸ Ratio A260/A280: Este ratio indica la contaminación de las muestras de ADN y ARN con proteínas. El ratio de un ADN puro está en el rango de ~1.8, mientras que el de un ARN puro debe ser ~2. Este mayor ratio está relacionado con el mayor ratio del uracilo (4.0) en comparación con el de la timina (1.47).
▸ Ratio A260/A230 Ratio: Este ratio permite establecer la contaminación de las muestras de ácidos nucleicos con contaminantes de la muestra o reactivos empleados en la purificación de los mismos, como pueden ser el fenol, las sales de guanidinio, carbohidratos, etc. Un ratio en el rango de 2.0-2.2 es considerado como óptimo y valores muy inferiores son indicativos de la presencia de contaminantes.
Figura 1. Espectro ultravioleta (220-300 nm) de ácidos nucleicos. A. Patrón típico de muestras de ADN puro. B. Patrón de un ADN contaminado. C. Patrón típico de muestras de ARN puro. D. Patrón de muestras de ARN contaminado.
Evaluación de la integridad de los ácidos nucleicos
La integridad tanto del ADN como del ARN es fundamental para obtener resultados experimentales precisos. La degradación de las muestras puede comprometer los resultados en técnicas como RT-qPCR, NGS o clonación. El gold standard para evaluar la integridad de los ácidos nucleicos es la electroforesis en gel de agarosa. La interpretación de la migración del ADN y ARN en el gel de agarosa es crucial para evaluar la integridad de los mismos.
Figura 2. Técnicas para la determinación de la integridad de los ácidos nucleicos. El ADN genómico debe visualizarse como una banda única de tamaño alrededor de 23 kb. En el caso del RNA se deben visualizar bandas nítidas de los ARN ribosomales de 28S, 18S y 5S. El ratio 28S/18S deber ser de 2. *, aplicaciones posteriores pueden requerir el tratamiento de las muestras con RNasas; a, si se observan los RNA ribosomales íntegros, el smear corresponde a los transcritos de distinto tamaño del RNA mensajero.
Existen otros enfoques, como la electroforesis en gel de campo pulsado para analizar fragmentos grandes de ADN y la electroforesis capilar para obtener una evaluación más precisa de la calidad del ADN y del ARN. Este método genera un electroferograma y permite el cálculo del número DIN o RIN, DNA o RNA Integrity Number, para el ADN o el ARN, respectivamente. Un valor de 10 para cualquiera de estos indicadores señala ADN o ARN intacto, mientras que valores más bajos reflejan distintos grados de degradación. En función de la aplicación posterior será necesario moléculas con mayor o menor grado de integridad.
Figura 3. Escala de los números de integridad de ADN (DIN) y ARN (RIN).
Conclusión
El control de calidad de los ácidos nucleicos es un paso esencial para garantizar la confiabilidad y reproducibilidad de los experimentos en biología molecular. La cuantificación mediante espectrofotometría y fluorometría permite conocer la concentración y pureza de las muestras, mientras que la evaluación de la integridad a través de electroforesis en gel de agarosa, electroforesis capilar o gel de campo pulsado proporciona información clave sobre su idoneidad para aplicaciones posteriores. La interpretación de los valores de pureza (A260/A280 y A260/A230) y de integridad (RIN, DIN) permite seleccionar muestras óptimas según los requerimientos experimentales. En definitiva, una evaluación rigurosa de cantidad, pureza e integridad es fundamental para evitar sesgos en los resultados y maximizar el éxito de los estudios moleculares.
Referencias
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