La separación en fases líquido-líquido es el procedimiento de extracción más utilizado en un laboratorio químico. Sin embargo, su principio de funcionamiento ha sido extendido a la purificación de biomoléculas como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, antibióticos, azúcares, alcaloides como la cafeína, etc. En este artículo, exploraremos los principios de la separación en fases líquido-líquido, los métodos más utilizados y su aplicación en la purificación de algunas biomoléculas.
Principios de la Separación en Fases Líquido-Líquido
La separación en fases líquido-líquido emplea la inmiscibilidad de dos líquidos con diferentes propiedades fisicoquímicas (polaridad, densidad, interacciones químicas específicas, etc). Su principio se basa en el coeficiente de distribución o partición, una constante de equilibrio que caracteriza cómo un compuesto de interés se distribuye entre las dos fases cuando se alcanza el equilibrio. Este coeficiente, que depende de factores como la polaridad del compuesto, la naturaleza de los solventes, el pH o la presencia de sales desnaturalizantes, permite que la sustancia de interés se ponga en contacto con el solvente inmiscible que favorece su extracción selectiva.
La correcta identificación de las fases en un sistema de extracción es crucial para su éxito. Generalmente, la fase orgánica es menos densa que la fase acuosa y se sitúa en la parte superior del sistema, aunque existen excepciones, como en las extracciones que hacen uso de compuestos más densos que el agua como el cloroformo o el diclorometano, donde la fase orgánica es más densa y queda en el fondo. Esta diferencia en densidad permite la separación física de ambas capas mediante el uso de embudos de separación o pasos de centrifugación.
Ejemplos de Métodos de Separación en Fases Líquido-Líquido
En biología molecular y en biotecnología, son purificadas moléculas de distinta naturaleza basados en la separación en fases líquido-líquido. Son ejemplos de ello los siguientes procesos:
A) Extracción de ácidos nucleicos con Fenol:Cloroformo
Uno de los métodos clásicos y más utilizados en la purificación de ADN es la extracción con fenol-cloroformo. El fenol desnaturaliza las proteínas y las separa del ADN, mientras que el cloroformo permite la separación en fases, observándose una fase superior acuosa que contiene los ácidos nucleicos, una interfase que contiene las proteínas desnaturalizadas y una fase inferior orgánica que contiene lípidos y otros contaminantes. El pH del fenol saturado que se emplea en estas extracciones favorece el aislamiento de ADN o ARN en la fase acuosa.
A pesar de la toxicidad de estos compuestos, este método de separación continúa en uso pues permite obtener ácidos nucleicos de alta pureza partiendo de grandes volúmenes de muestra.
El método descrito por Chomczynski y Sacchi para la extracción de ARN fue publicado en uno de los artículos más influyentes en la biología molecular de las últimas décadas con más de 60.000 citaciones. El mismo, base del reactivo Tiarizol™ y otros reactivos similares, basa su eficiencia en la separación en dos fases líquidas utilizando una mezcla fenólica de tiocianato de guanidinio y cloroformo. En este procedimiento, la muestra biológica se homogeneiza en presencia de guanidinio que actúa como un potente agente desnaturalizante que inactiva nucleasas y disocia complejos ribonucleoproteicos, protegiendo el ARN de la degradación. Tras un paso de centrifugación, la fase acuosa, que queda en la parte superior, contiene el ARN puro, mientras que la fase orgánica e intermedia retiene las proteínas y el ADN; posteriormente, el ARN se precipita añadiendo isopropanol. El ARN se obtiene en altas concentraciones y con una pureza adecuada para estudios genómicos, transcriptómicos y proteómicos.
B) Aislamiento de ADN viral empleando sistemas poliméricos bifásicos
Los sistemas bifásicos acuosos (ATPS, acrónimo de Aqueous Two-Phase Systems) son mezclas de dos polímeros solubles en agua (ej. polietilenglicol y dextrano) que forman dos fases líquidas inmiscibles. Estos sistemas se utilizan para la separación de biomoléculas según su carga y tamaño. Este sistema se suele emplear como primer paso de la purificación del ADN de adenovirus. La muestra biológica se mezcla con una solución de polietilenglicol (PEG) y dextrano y tras separar las fases por centrifugación, el ADN viral se concentra en la fase superior (PEG) mientras que los contaminantes celulares quedan en la fase inferior (dextrano).
C) Extracción de lípidos con Cloroformo: Metanol
Los lípidos, al igual que otras sustancias, experimentan fenómenos de partición al ser expuestos a mezclas de líquidos inmiscibles. La extracción con cloroformo-metanol en relación 2:1 (método de Folsch) o 1:2 (método de Bligh & Dyer) son procedimientos de referencia ampliamente empleados en la separación de lípidos. En ambos casos, la fase inferior orgánica es la fase de interés pues contiene los lípidos, mientras que en la fase acuosa quedan las proteínas y los hidratos de carbono.
D) Eliminación de la cafeína usando diclorometano.
La cafeína es un alcaloide que actúa como estimulante y psicoactivo. Para la obtención de bebidas descafeinadas se suele usar el principio de la separación en fases líquido-líquido. La cafeína si bien es una molécula con una alta solubilidad en agua, tiene mayor afinidad por algunos disolventes orgánicos, como el cloroformo y el diclorometano. En el proceso de descafeinización del café crudo, se utiliza la adición de diclorometano a la mezcla acuosa del café. Tras la formación de las dos fases, la cafeína es extraída en la fase orgánica; el diclorometano es altamente volátil y es eliminado en su totalidad en la fase final de la elaboración.
Conclusión
Los métodos de separación en fases líquido-líquido son esenciales en biotecnología y biología molecular. La elección del método depende del tipo de muestra, el grado de pureza requerido y la aplicación final. Si trabajas en biotecnología o diagnóstico molecular, la comprensión de la separación de biomoléculas en fases líquido-líquido, te permitirá disponer de una herramienta valiosa para tus investigaciones.
Referencias
